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產地 | 進口、國產 |
品牌 | 帛科 |
貨號 | BKP6920 |
用途 | 公司產品僅用于科研 |
包裝規格 | 50T |
純度 | 詳見說明書% |
CAS編號 | |
是否進口 | 是 |
概述:
熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過程中,隨著PCR循環數的遞增,PCR產物不斷積累,熒光信號也會相應的增加,這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應進行實時的監測。產品僅供科研使用本公司根據您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監測, 實現基因的相對定量、定量和定性分析。
產品名稱 | 英文名稱 | 貨號 |
犬小孢子菌探針法熒光定量PCR試劑盒 | Microsporum canis | BKP6920 |
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的:
1)Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現性極好,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現性*的定量方法,已得到全世界的公認,廣泛用于基因表達研究、轉基因研究,藥物考核、病原體檢測等諸多領域。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖:
使用方法:
一、犬小孢子菌探針法熒光定量PCR試劑盒稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)
1. 注意:由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中,充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品,必須設置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號(濃度為1×10E4 拷貝/μL,10μL相當于1萬拷貝)或第5號(濃度為1×10E5 拷貝/μL,10μL相當于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設置qPCR反應(20 μL體系,在樣品制備室進行)
10. 如果只做1次重復,則標記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復,則反應設置數量相應增加2或3倍。
11. 產品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加)
熒光定量PCR服務:
產品僅供科研使用簡介:實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化;比較不同組織的mRNA表達差異;驗證基因芯片,siRNA干擾的實驗結果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術服務,全部實驗皆使用進口試劑完成,主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務要求:
(01)請您提供新鮮的且盡量多的材料;或直接提供純化好的總RNA(大于 5 ug/樣品);或直接提供純化好的DNA(大于 5 ug/樣品)。
(02)請提供已知的全長基因序列。
(03)請提供盡可能詳細的背景資料:DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
(01)引物(探針)設計與合成。
(02)提取DNA/RNA,樣本逆轉錄成cDNA。
(03)進行Real Time PCR實驗,進行實驗結果分析。
(04)實驗完成后,提供完整的實驗報告(含軟件分析結果)及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準:
我公司根據客戶的樣品數量進行不同的收費標準。
小鼠色素瘤細胞;B16-F1N-Acetyle-D-LeucineN-乙酰-D-白酸1克BR,99%
Hep3B2.1-7細胞,人細胞 人髓母細胞瘤細胞,D341Med細胞 中國倉鼠卵巢細胞;CTLA4 Ig-24Nα-FMOC-Nω-PBF-D... Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH,≥98.0% 187618-60-6 1G 通用試劑
NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Sain L](小鼠成纖維 5×106cells/瓶×2啊魏醋;4-羌基3-氧基肉桂醋;咖非醋-3-迷 Fqrulic ccid;3-Mqthoxy-4-xy7noxy cinncMic ccid;Ccffqic ccid 3-Mqthyl qtqr;3-(4-xy7noxy-3-Mqthoxyphqnyl)-2-propqnoic ccid 237-98-4
Promocell C-28014 Mesenchymal Stem CellChondrogenic Diff. Medium w/o, 間充質干細胞軟骨分化培養基無誘導劑(即用型) 100ml5-溴-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷,英文名或英文縮寫:Bluo-Gal,級別:BR,98%,規格:5克
人海馬趾神經元RNAHN-h miRNA5 μg82905-08-6姆沙伯 108CHROMOSORB(R) 108
CD200R1 Others Mouse 小鼠 CD200R1 / OX-2R 人細胞裂解液 (陽性對照) DEAD二乙基偶氮二羧酸酯1克AR,98%
滑膜細胞Many types of cells包裝:5 × 105方(1ml)1.3-丁二1¤ 1,3-Butcdiqnq;Bivinyl;Divinyl;qrythrqnq;Biqthylqnq;α,γ-Butcdiqnq;Vinylqthylqnq;Pyrrolylqnq 106-99-0
TNFRSF11A Others Rat 大鼠 TNFRSF11A 人細胞裂解液 (陽性對照) 錄化亞工 MqRCUROUS CHLORIDq 1011-91-1
大鼠大隱內皮細胞完全培養基 100mLChlorobutanol錄丁醇500克AR,85%
293FT人胚腎細胞-用于慢病毒包裝 Human embryonic kidney cell line 293FT - for leiviral packaging 人胚腎細胞3130-87-8DL-天冬堿DL-Asparagine monohydrate
CL-0077Eca-109(人細胞)5×106cells/瓶×2吲哚菁綠Indocyanine Green質量規格:>94%,BS
Wish細胞,人羊膜細胞系 人T細胞瘤,Hat-78細胞 小鼠誘導性多潛能干細胞;PUMC-mips-A2靛藍Indigotin質量規格:BS
BGC823(人細胞) 5×106cells/瓶×2甲基藍Methyl blue質量規格:AR
CTSB Others Human 人 Cathepsin-B / CTSB 人細胞裂解液 (陽性對照) 伊文思藍;埃文斯藍Evans Blue質量規格:BS,進分BIOFER,>85%
中國倉鼠卵巢細胞(亞系克隆);CHO-HCV-p7曲利苯藍Trypan Blue質量規格:BS
犬小孢子菌探針法熒光定量PCR試劑盒人關節軟骨細胞完全培養基 100mL醋酸氟氫可的(標準品)Fludrocortisone acetate質量規格:含量97%-103%,標準品
Vero細胞,綠猴腎細胞 RSC96(大鼠雪旺細胞) 小鼠瘤株;S180醋酸氟氫可的Fludrocortisone acetate質量規格:>97%
EFNB2 Protein Human 重組人 Ephrin-B2 / EFNB2 蛋白阿折地平Azelnidipine質量規格:>99%,BR
U-937(人組織細胞瘤細胞) 5×106cells/瓶×2 小鼠瘤細胞;EL4噻奈普汀酸;噻奈普汀Tianeptine質量規格:>98%,BR
人平滑肌細胞裂解物HCSMCL噻奈普汀酸;噻奈普汀(標準品)Tianeptine質量規格:HPLC>99%,標準品
實驗過程:
一、試劑準備
1. DNA模板
2.對應目的基因的特異引物(在PCR反應中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據你的模板鏈設計。因此,擴增不同的基因需要設計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結束反應,PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
1.PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
2.純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結果,純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
4.PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應該以大體積配制,試驗一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實驗與實驗之間的連續性。
6.試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應在冰浴上化開,并且要充分混勻。